|
随着纳米科学的迅速发展，各种各样的磁性纳米材料被成功地合成出来，并开始应用于磁性存储介质、生物传感器、药物转运载体和污水处理等领域。Fe3O4纳米粒子由于结构相对简单、成本低、毒性低、比表面积较高以及吸附性能良好得到广泛应用。为了改善Fe3O4磁性纳米粒子材料的选择吸附性能，提高捕获中草药及食品靶点的能力，诸多功能基团如巯基（-SH）、氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、磺酸基（-SO3H）、羟基（-OH）等被用于提取材料的改性。在样品预处理中，相比较传统固相萃取（SPE），磁性固相萃取（MSPE）中将磁性（Fe3O4）纳米粒子作为吸附剂，已经吸引了相当多的关注。张卓琦等制备了磁性介孔纳米粒子并负载了抗癌药紫杉醇，提高了其对人宫颈癌HeLa细胞的抑制率。Wu等制备了氧化石墨烯复合磁性纳米材料从茶、葡萄酒和尿液样本中提取黄酮类成分。虽然，磁性纳米粒子的独特特征已经引起的生物医学科学领域的广泛关注，但将其应用于食品和中药中化合物提取研究仍较少。
本研究构建了MNP-NH2磁性纳米材料，探索其对黄酮类及有机酸类化合物的吸附规律，并将MNP-NH2作为提取剂，首次应用到金银花药材中提取黄酮类及有机酸类成分，开发了其从植物来源的中药、食品中提取单体化合物的潜力。为MNP-NH2应用于中草药、天然药物及食物中黄酮类及有机酸类成分的提取提供依据。
1 材料
1.1 原料及试剂
对照品木犀草素（批号20160709）、木犀草苷（批号20160709）、花旗松素（批号20161211）、二氢杨梅素（批号20160705）、芦丁（批号20160709）、柚皮素（批号20160607）、绿原酸（批号20161210）、咖啡酸（批号20160610）、水杨酸（批号20161210）、莽草酸（批号20160721）、原儿茶酸（批号20160911）、没食子酸（批号20160908）购自南京泽朗医药公司（经HPLC测定，质量分数≥98%）。金银花药材产于山东，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或带初开的花。
FeCl3•6H2O、1,6-己二胺、无水乙酸钠（NaAc）购于阿拉丁试剂公司；乙二醇、无水乙醇购于天津科密欧试剂有限公司；磷酸购于天津市福晨化学试剂厂；磷酸钠，氢氧化钠购于天津市化学试剂批发公司；色谱甲酸、乙腈购自美国Sigma公司；所用水为屈臣氏蒸馏水。
1.2 仪器
Sartorius BT125D十万分之一天平，赛多利斯科学仪器有限公司；JA31002电子天平，上海精天电子仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；KH3200B超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；DHG-9030A电热鼓风干燥箱，北京博达科技公司；DZF-6020MBE真空干燥箱，杭州科晓化工仪器公司；DF-101S型集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器公司；DELTA 320 pH计，瑞士Mettler Toledo公司；Waters2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；PPMS-9振动样品磁强计，美国量子设计公司。JEOL JSM 6700F型扫描电子显微镜（SEM），日本Jeol公司；Hitachi H-800型透射电子显微镜（TEM），日本Hitachi公司；Bruker 550型傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪，德国Bruker公司。
2 方法与结果
2.1 MNP-NH2磁性纳米粒子制备
采用经典的溶剂热合成法制备MNP-NH2，称取FeCl3•6H2O（1.5 g）和1,6-己二胺（4.0 g）置于圆底烧瓶中，加入50 mL乙二醇，充分搅拌、超声，使块状的固体溶解，加入NaAc（4.5 g）继续剧烈搅拌30 min，使之形成均一的黏稠液体，溶液颜色由浅黄色逐渐变为深棕色；将混合溶液转移到50 mL的反应釜中，密封后放入烘箱，在200 ℃下反应10 h；冷却至室温后用钕铁硼磁铁分离出黑色固体MNP-NH2，依次分别用去离子水和无水乙醇各超声洗涤3次，60 ℃条件下真空干燥8 h，制得MNP-NH2。
2.2 MNP-NH2的表征测试
2.2.1 电镜分析 采用SEM测定MNP-NH2纳米粒子的形貌特征，真空度大于1.33×10−6Pa，加速电压3.0 kV，放大倍数80 000。通过TEM分析MNP-NH2的特征，观察样品的精细结构。加速电压200.0 kV，放大倍数200 000，真空度大于10−6Torr（1 Torr约为133.3 Pa），拍摄MNP-NH2的粒子形貌。
由溶剂热合成法制得的MNP-NH2主要为球状结构，磁性纳米粒子表面被氨基修饰可以保护Fe3O4被氧化，最后制得形貌规则、结构稳定、分布均匀的MNP-NH2复合材料。由图1、2测试图谱可知，MNP-NH2纳米粒子粒径大小约20 nm，分布较为均匀，基本为单层，似球形，局部有颗粒聚集和叠加。
 
2.2.2 FT-IR分析 采用KBr压片，波数范围400～4 000 cm−1，分辨率4 cm−1，扫描次数32次。测定MNP-NH2纳米粒子结构中化学官能团的结构特征。MNP-NH2的红外光谱图见图3，在586 cm−1处为Fe-O-Fe键的特征吸收峰；1 650 cm−1处的吸收峰是由O-H的弯曲振动产生的，说明Fe3O4和MNP-NH2表面存在一些-OH基团。3 379、1 261 cm−1的特征吸收对应氨基的N-H强伸缩振动吸收和C-N伸缩振动吸收，说明反应后磁性粒子表面生成了氨基功能基团。
2.2.3 磁性测试分析（VSM） 振动样品磁强计适用于各种磁性材料的测量。本实验采用美国量子设计公司的超导量子干涉器件测定MNP-NH2纳米粒子的磁滞回线。从图4中可以明显看出，在无外加磁场情况下，制备的MNP-NH2能均匀的分散在溶液中，当有外加磁场时（即磁铁靠近时），MNP-NH2能迅速向磁场方向聚集，均一的分散液迅速出现分层现象；Fe3O4及MNP-NH2的饱和磁化强度（M）分别为92.26、76.35 emu/g，MNP-NH2的M降低，是由于MNP-NH2表层被修饰了一定量的-NH2，影响了M，从而降低了MNP-NH2的磁矩。当外加磁场强度（H）降为零时，磁性样品的矫顽力和剩磁都几乎为零，且几乎观察不到磁滞现象，因此这种磁性纳米粒子非常适合用做载体。
2.3 MNP-NH2对中药单体成分吸附性考察
2.3.1 色谱条件 色谱柱为WatersSymmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相及等度洗脱比例的确定依据《中国药典》2015年版相关化合物检测条件并适当调整，结果见表1；体积流量1 mL/min；进样量10 μL；温度30 ℃。
2.3.2 对照品溶液的配制 取木犀草素、木犀草苷、花旗松素、二氢杨梅素、芦丁、柚皮素、绿原酸、咖啡酸、水杨酸、莽草酸、原儿茶酸、没食子酸对照品适量，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，4 ℃保存即得对照品储备液。
2.3.3 样品溶液吸附 分别取12种中药单体成分样品溶液各5mL，每份加入1 mg磁性纳米粒子，混合均匀后在室温下超声40 min，借助外加磁铁实现磁性纳米粒子与样品液的分离（固液分相），吸取上清液，以微孔有机滤膜滤过，分别测定吸附前样品液、吸附后上清液中指标成分的质量浓度。
2.3.4 线性关系考察 精密称取各对照品储备液适量，按倍数用甲醇逐级稀释，配制成一系列对照品溶液，按“2.3.1”项色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），各对照品质量浓度为横坐标（X），得回归方程见表1，r均在0.999以上，在线性范围内线性关系良好。
2.3.5 吸附过程 以MNP-NH2作为吸附载体，将12种中药单体成分储备液分成实验组和空白组，在实验组中加入一定量的磁性纳米粒子，未加入磁性纳米粒子的原料液（或者标准溶液）作为空白组，超声处理。实验组在外加磁场作用下实现磁性纳米粒子与原料液的分离（固液分相），取上清液过膜，空白组直接过膜，进样分析，得到吸附前后的液相色谱图，按公式计算出饱和吸附量（Q）。磁性纳米粒子Q的计算公式为Q＝[(C0－C1)V1]/M，其中C0是起始质量浓度（mg/mL），C1是吸附平衡后的质量浓度（mg/mL），V1是加入各单体成分溶液的体积（mL），M是MNP-NH2磁性纳米粒子的质量（g）。
2.3.6 MNP-NH2对中药单体成分吸附效果 研究主要考察了氨基铁纳米粒子对不同中药单体成分的吸附情况。称取相同质量的氨基铁纳米粒子与相同浓度的12种中药单体成分在相同条件下进行分离提取，氨基铁纳米粒子对12种中药单体成分吸附结果见图5。MNP-NH2对中药单体的吸附考察中，吸附率由大到小依次为木犀草素＞芦丁＞木犀草苷＞二氢杨梅素＞没食子酸＞绿原酸＞咖啡酸＞花旗松素＞原儿茶酸＞莽草酸＞水杨酸＞柚皮素。研究发现，MNP-NH2的吸附率与黄酮类和有机酸类化合物的邻位酚羟基的存在和羟基个数有关，邻位酚羟基越多被吸附的量越大。
2.4 MNP-NH2对金银花中5种活性成分选择性吸附研究
将制备的MNP-NH2纳米材料作为吸附剂，研究MNP-NH2对金银花中黄酮类成分木犀草苷、木犀草素、芦丁及有机酸类成分绿原酸、咖啡酸的吸附性能。
2.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，10%～20%乙腈；15～30 min，20%～55%乙腈；30～40 min，55%～10%乙腈；40～45 min，10%乙腈；检测波长350 nm；体积流量1 mL/min；进样量10 μL；温度30 ℃。HPLC色谱图见图6。
2.4.2 混合对照品溶液的制备 取对照品绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素适量加甲醇定溶于10 mL量瓶中，即得。
2.4.3 金银花样品溶液的制备 取10 g金银花，加30倍水，浸泡30 min，水浴提取1 h，提取2次，合并滤液并混匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，4 ℃冰箱保存，即得。
2.4.4 金银花样品溶液吸附 取5 mL金银花样品溶液，加入100mg氨基铁，与5 mL未加氨基铁母液，30 ℃超声40 min，磁铁分离后，离心13 000 r/min，10 min，进液相；剩余铁加5 mL洗脱液，超声40 min，进行洗脱，固液分离，取洗液过膜，按照“2.4.1”项下金银花色谱条件进样，得到吸附前、后的HPLC图，计算出Q值。
2.4.5 方法学考察 精密度、重复性、稳定性试验中金银花中的5种成分绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、芦丁的保留时间RSD＜2%、峰面积 RSD＜3%，均符合要求，表明精密度、重复性良好，样品在24 h内稳定。
2.4.6 吸附条件考察 取相同质量浓度的5种化合物溶液各5 mL，加入适量的MNP-NH2，恒温超声。分别用pH值为3、4、5、6、7、8磷酸盐水溶液稀释5种化合物储备液，于25 ℃下的恒温超声40 min，考察pH值对MNP-NH2吸附性能的影响，结果见图7-A。分别在0、15、30、45 ℃下，考察超声温度对MNP-NH2吸附性能的影响，结果见图7-B。分别用0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的NaCl溶液稀释5种化合物储备液，于25 ℃下恒温超声40 min，考察离子浓度对MNP-NH2吸附性能的影响，结果见图7-C。分别在0、5、10、15、20、25、30、40、50 min下，考察超声时间对MNP-NH2吸附性能的影响，结果见图7-D。
结果显示，吸附时间在40 min时，基本都达到最大吸附平衡；离子浓度和温度对吸附过程几乎不影响。pH值在MNP-NH2对不同类化合物的吸附过程中影响较大，当pH值为3时，MNP-NH2对木犀草素与木犀草苷吸附最小，在pH值为5时，5种成分相对吸附量较高，在不同pH值下，5种化合物吸附存在一定差异。最终选择30 ℃下超声40 min作为最佳吸附条件。
2.4.7 洗脱条件考察 影响MNP-NH2洗脱效果的的主要因素有冰乙酸体积分数（A，10%、20%、30%）、甲醇体积分数（B，40%、60%、80%）、洗脱时间（C，15、30、45 min）和洗脱体积（D，3、5、7 mL）4个试验因素。采用L9(34) 进行4因素3水平的正交试验，收集洗脱液按“2.4.1”项下方法检测溶液中中药单体成分的质量浓度，计算洗脱率，并对结果进行方差分析。结果见表2～4。
由方差分析（表4）可知，对绿原酸的吸附率因素中无显著性差异；对咖啡酸的吸附率因素中A和D有显著性差异；对芦丁的吸附率因素中B和D有显著性差异；对木犀草苷的吸附率因素中A、B和D有显著性差异；对木犀草素的吸附率因素中A、B和D有显著性差异。
结合直观分析（表3）和方差分析，最终确定最佳洗脱条件为加5 mL 20%冰乙酸液（甲醇-水60∶40）洗脱液，超声40 min。
2.4.8 MNP-NH2循环利用性能 为考察MNP-NH2的循环利用性能，将其重新用于金银花样品液的吸附，重复进行8次。测得8次循环中MNP-NH2对金银花样品液的脱附率见图8、9。MNP-NH2在吸附洗脱8次后，对金银花中有效成分木犀草素、木犀草苷、芦丁和咖啡酸保持较高的吸附率，达到50%以上；在循环洗脱过程中对芦丁、木犀草苷和木犀草素保持较高的洗脱率，达到80%以上。综上所述，MNP-NH2具有良好的循环再利用特点，这也为将来的实际应用提供坚实的基础。
 
3 结论与讨论
本实验采用水热法制备得到MNP-NH2磁性纳米粒子，氨基成功修饰在磁性纳米粒子表面，MNP- NH2复合粒子形貌规则、结构稳定、分布均匀且具有良好的磁性及循环再利用特点，可用于下一步吸附。MNP-NH2对金银花提取液中黄酮类成分相对有机酸类成分吸附率要高，而且洗脱的过程中两类化合物的差异较显著，对金银花中有效成分提取分离中具有潜在应用。
制备的MNP-NH2表面被修饰上丰富的氨基，与传统分离纯化方法，如大孔树脂等相比，本方法最显著的优点就是选择性强，操作简便能够直接从金银花提取液中分离出单体化合物，整个分离过程省时省力、操作简单易控，通过外加磁场即可实现吸附载体与原料液的分离，是一种很好的分离纯化方法。有望应用于中药材等复杂成分体系中黄酮类及有机酸类化合物的提取分离系统中。
参考文献（略）
来 源：曹雪晓，栗焕焕，邱喜龙，任晓亮，王 萌，裴高升. 氨基表面修饰磁性纳米粒子（MNP-NH2）对黄酮类和有机酸类成分选择吸附研究 [J]. 中草药, 2018, 49(20):4816-4823.
|
